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Molecular Cancer | 唐军/朱孝峰合作发现超级增强子驱动抑癌基因表达及其在乳腺癌中异常表达的调控机制

10月16日
综述
来源:肿瘤资讯

超级增强子(super enhancers,SEs)是具有转录活性增强子的一个大簇,富集高密度的关键转录因子、辅因子和增强子表观修饰标记,驱动控制细胞身份基因的表达,从而在调控细胞命运中发挥重要作用。基因组研究发现,相比于成人肺癌、黑色素瘤等,乳腺癌的频发突变相对较少。为了寻找更多的乳腺癌治疗靶点,近年来研究者开始更多地关注超级增强子的研究。尽管目前已有的研究表明乳腺癌的发生发展与超级增强子功能异常有关,尤其是超级增强子通过驱动关键癌基因表达促进乳腺癌的进展,但超级增强子如何驱动抑癌基因的表达来调控乳腺癌的发生发展尚不清楚。

               
唐军
博士 主任医师 博士生导师

中山大学肿瘤防治中心乳腺科行政副主任
中国医促会乳腺癌分会青年委员会副主委
中国医促会乳腺癌分会常委
中国整形美容协会肿瘤整复分会常委
中国南方临床协作组SWOG常委
中国抗癌协会肿瘤整形分会委员
国家自然基金评审专家
广东省医师协会乳腺分会外科组组长
广东省抗癌协会乳腺癌专业委员会委员
MD Anderson 癌症中心高级访问学者
开发多项技术对亚临床乳腺癌进行定位活检诊治;胸腔镜辅助内乳区前哨淋巴结活检与清扫;开展乳房重建与整形,致力于将乳腺癌保乳手术和乳房重建相结合。发表SCI论文30余篇,主持国家自然基金3项,省、部级科研立项12项

               
朱孝峰
教授,博士生导师

中山大学肿瘤防治中心华南肿瘤学国家重点实验室副主任、实验研究部主任、课题负责人、教授、博士生导师,广东省“特支计划”百千万工程领军人才,教育部新世纪优秀人才。

现任中国抗癌协会抗癌药物专业委员会常委

肿瘤精准治疗专委会常委

广东省抗癌协会抗肿瘤药物专业委员会主委

2014-2019年曾任广东省药理学会肿瘤药理专业委员会主任委员

主要从事肿瘤信号转导与靶向治疗研究。主持国自然重点项目(1项)、国自然青年面上项目(8项)、 “973”计划课题(组长)、广东省自然重点及广东省科技计划等项目。主编人民卫生出版社出版的《信号转导》和广东科技出版社出版的《肿瘤生物治疗学》专著二部。申请专利9项,已授权专利5项。近年作为通讯作者在Nature Communications (3篇), Molecular Cancer, Clinical Cancer Research,  Autophagy(4篇), Leukemia,Oncogene(4篇)等国际知名专业刊物上发表SCI收录论文40余篇。

主要学术成绩包括:1.阐明肿瘤细胞自噬体成熟调控新机制,发现靶向自噬发挥抗瘤作用的新靶点;2. 发现DNA损伤类抗肿瘤药物通过自噬发挥抗瘤作用的新机制,从而指导抗肿瘤药物临床联合应用及个体化治疗;3.发现靶向AKT的结构新颖药物候选物,为研发新型抗肿瘤药物奠定坚实基础。

唐氏综合征即21-三体综合征,又称先天愚型,是由染色体异常(多了一条21号染色体)而导致的疾病。大规模流行病学调查显示唐氏综合症患者患实体瘤尤其是乳腺癌、宫颈癌、肺癌的几率显著低于正常人群[1]。这一特点促使人们寻找位于21号染色体上的抑癌基因。经不懈努力,科学家发现唐氏综合症患者实体瘤发生率低的原因与钙调磷酸酶调节蛋白1 (regulators of calcineurin,RCAN1)相关[2],[3]。这些研究结论有力地提示了RCAN1基因可能与肿瘤发生发展密切相关。然而,RCAN1在乳腺癌中的表达调控和功能尙不清楚。针对这一科学问题,作者展开了一系列的研究。2020年8月11日,中山大学肿瘤防治中心唐军/朱孝峰合作在Molecular Cancer发文题为Disruption of super-enhancer-driven tumor suppressor gene RCAN1.4 expression promotes the malignancy of breast carcinoma 的研究成果。该研究揭示由于关键转录因子RUNX3在乳腺癌中的低表达,致使调控RCAN1.4表达的远端超级增强子驱动异常,导致RCAN1.4表达减少;RCAN1.4的低表达可以通过激活CaN(钙调神经磷酸酶)/NFATc1通路促进乳腺癌的恶性进展。

RCAN1,最早发现于唐氏综合症关键区域1(Down Syndrome Critical Region,DSCR1)的q22.12 区域。RCAN1基因有7个外显子,被6个内含子隔开,其中外显子1~4 可被选择性剪切产生不同的mRNA 转录产物。作者通过分析TCGA乳腺癌数据和中山大学肿瘤防治中心收集的乳腺癌标本,发现乳腺癌组织中可以存在RCAN1.1, RCAN1.2和RCAN1.4三个转录本的剪切形式;RCAN1.1 和RCAN1.2转录本在癌组织中的表达与癌旁正常组织无差别,而RCAN1.4转录本在癌组织中的表达显著低于癌旁正常组织;RCAN1.4低表达的患者无复发生存率(RFS)和总生存率(OS)更低,且是独立的不良预后因素。在探讨RCAN1.4 在乳腺癌中的生物学功能时,作者发现特异性靶向RCAN1.4的sgRNA敲除其表达能显著促进乳腺癌细胞的迁移侵袭、转移至骨和脑组织的能力;特异性过表达RCAN1.4能显著抑制乳腺癌细胞的成瘤、侵袭迁移能力;RCAN1.4在乳腺癌细胞中负性调控CaN/NFATc1下游靶基因如IL-11, COX2, MDM-2, IGF1等的mRNA表达;通过钙调磷酸酶抑制剂环孢素A,或者用siRNA 干扰NFATc1和CaN表达后,可抑制RCAN1.4缺失乳腺癌细胞的侵袭迁移能力。以上结果说明RCAN1.4在乳腺癌中低表达,并通过负性调控CaN/NFAT通路在乳腺癌的发生发展中发挥重要作用。

图片1.png接下来作者深入探讨RCAN1.4基因在癌组织中转录水平上低表达的可能原因。作者发现RCAN1.4基因的表达受远端超级增强子的严密调控。分析ENCODE数据库和GSE72141数据的ChIP-seq数据(包括H3K27Ac, H3K4me1, H3K4me3)和RNA-seq数据显示,在RCAN1.4的核心启动子区(chr21:35,897,827 -35,900,402)下游约266kb的区域存在调控RCAN1.4表达的远端超级增强子(RCAN1.4-SEdistal),原因如下:(1) 这段区域由多个增强子串联而形成长约23 kb长片段增强子区;(2) 这段区域位于基因组上的DNA酶Ⅰ超敏感位点上;(3)这段区域存在H3K27Ac/H3K4me1高reads峰值,与RCAN1.4的启动子区域H3K27Ac/ H3K4me3的reads峰值及第一个外显子的RNA的reads峰值是匹配的,呈正相关。于是作者通过Interactive Hi-C Data Browser (http://promoter. bx.psu.edu/hi-c/view.php) 分析发现在HMEC细胞中RCAN1.4的核心启动子区和远端超级增强子区存在于同一个拓扑关联域(TAD) 。进一步实验证实该远端超级增强子能显著增强RCAN1.4的转录活性;靶向 BRD4的特异siRNA和抑制剂JQ1能够显著抑制乳腺癌细胞RCAN1.4 的核心启动子和超级增强子的活性,并下调RCAN1.4 的mRNA和蛋白水平。为了进一步明确远端超级增强子对RCAN1.4表达和生物学功能的调控作用,作者运用double-CRISPR 基因编辑技术敲除了RCAN1.4对应的超级增强子序列(~20kb)。结果显示,远端超级增强子的缺失导致RCAN1.4表达几乎完全丧失,而RCAN1.1,RCAN1.2和同一染色体上的其他基因(如RUNX1)则不受影响;同时,RCAN1.4-SEdistal的缺失也显著促进了乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力。这表明该远端超级增强子对RCAN1.4的严密调控作用。

转录因子在调控超级增强子的活性方面发挥了至关重要的作用。为了探讨超级增强子调控RCAN1.4在乳腺癌中异常表达的分子机制,作者通过分析ENCODE中的Transcription Factor ChIP-seq数据和TCGA乳腺癌数据库,筛选出转录因子RUNX3可能在超级增强子调控RCAN1.4在乳腺癌中异常表达发挥了关键作用。根据JASPAR数据库转录因子结合位点的预测结果,通过构建野生型和突变型(结合位点突变)荧光素酶报告质粒以及ChIP-qRCR等技术,作者明确RUNX3通过与RCAN1.4的远端超级增强子区的特定DNA序列(GTGGTGGT TT)直接结合,正向调控RCAN1.4超级增强子的活性,进而在转录水平上调控RCAN1.4的表达。通过分析RUNX3/RCAN1.4在乳腺癌组织中的联合表达对患者病程进展和治疗反应的影响,作者进一步阐明由于关键转录因子RUNX3在乳腺癌中的低表达,致使调控RCAN1.4表达的远端超级增强子驱动异常,导致RCAN1.4表达减少的机制,从超级增强子角度揭示乳腺癌恶性演进过程中RCAN1.4低表达的原因。

图片2.png总的来说,该研究阐明了转录因子RUNX3介导超级增强子驱动异常,致使RCAN1.4在乳腺癌中低表达的调控机制,提出超级增强子对抑癌基因调控异常也能促进乳腺癌的发生发展。由于RCAN1.4和RUNX3同时低表达的乳腺癌患者具有极差的预后,RUNX3-RCAN1.4轴有望作为乳腺癌的新型预后生物标志物和治疗靶标。另外,许多肿瘤细胞关键致癌基因是由超级增强子驱动的,因此超级增强子已被视为是一种有前途的肿瘤治疗靶点[4]。确实,BRD4抑制剂(BETi)被证实能显著抑制包括三阴乳腺癌在内的多种肿瘤细胞的增殖并促进细胞凋亡[5]。然而,值得注意的是,当使用BETi进行癌症治疗时,靶向SEs可能会导致显著的副作用,因为一些抑癌基因的表达在阻断SEs时也会被抑制。正如在本研究中观察到BRD4抑制剂JQ1或BRD4的敲低以时间和剂量依赖的方式特异性地降低抑癌基因RCAN1.4的mRNA和蛋白质水平。这至少部分解释了为什么JQ1不能在实体瘤中获得良好的抗肿瘤效果。因此,作者提出在将SEs作为乳腺癌治疗靶点之前,还需要对SEs如何调控乳腺癌抑癌基因的表达及其机制进行更多的研究和更好的理解。

中山大学肿瘤防治中心邓蓉副教授、硕士研究生黄俊王燕住院医师,硕士研究生周丽欢为该论文共同第一作者;中山大学肿瘤防治中心唐军主任医师、孝峰教授为该论文共同通讯作者。 


参考文献

1 Hasle, H., Friedman, J. M., Olsen, J. H. & Rasmussen, S. A. Low risk of solid tumors in persons with Down syndrome. Genetics in medicine : official journal of the American College of Medical Genetics 18, 1151-1157, doi:10.1038/gim.2016.23 (2016).

2 Baek, K. H. et al. Down's syndrome suppression of tumour growth and the role of the calcineurin inhibitor DSCR1. Nature 459, 1126-1130, doi:10.1038/nature08062 (2009).

3 Ryeom, S., Baek, K. H. & Zaslavsky, A. Down's syndrome: protection against cancer and the therapeutic potential of DSCR1. Future oncology 5, 1185-1188, doi:10.2217/fon.09.88 (2009).

4 He, Y., Long, W. & Liu, Q. Targeting Super-Enhancers as a Therapeutic Strategy for Cancer Treatment. Frontiers in pharmacology 10, 361, doi:10.3389/fphar.2019.00361 (2019).

5 Shu, S. et al. Response and resistance to BET bromodomain inhibitors in triple-negative breast cancer. Nature 529, 413-417, doi:10.1038/nature16508 (2016).

责任编辑:肿瘤资讯-Nathan
排版编辑:肿瘤资讯-Yezi

                 

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